子宮內(nèi)膜異位癥( endometriosis,EM)是子宮內(nèi) 膜腺體和間質(zhì)種植于子宮以外的一種慢性、雌激素 依賴性疾病, 在育齡期女性中發(fā)病率為 10% ~ 15% 。 EM 雖是一種良性疾病,卻具有發(fā)病范圍 廣、癥狀多樣、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的惡性行為,至今其 病因及發(fā)病機制仍不清楚。 目前 EM 的治療手段主 要包括手術(shù)和激素類藥物,但療效均不理想。 因 此,子宮內(nèi)膜異位癥是婦科學(xué)研究的熱點和難點 之一。然而,目前 EM 盆腔纖維化的形 成機制尚不清楚。 構(gòu)建一種高效的子宮內(nèi)膜異位癥動物模型將 有助于對本病發(fā)病機制的認(rèn)識和新藥的開發(fā), 同時 可以為探索子宮內(nèi)膜異位癥纖維化發(fā)病機制提供理想模型。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物
90 只 SPF 級 6 周齡性成熟 BALB / c 雌小鼠,體重 18 ~ 20 g, 溫度 22 ~ 25℃ ,濕度 55% ~ 60%,12 h光照和12 h 黑暗交替,實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周。
1. 1. 2 試劑與儀器
苯甲酸 β-雌二醇( Sigma,E2758),實驗用芝麻油(Acros organics,241002500)
兩套眼科常規(guī)手術(shù)器械(剪刀、鑷子、止血鉗)、 注射用生理鹽水、1 mL 注射器、20 mL 注射器等。
1. 2. 1 藥物配制
稱取 1. 5 mg 苯甲酸 β-雌二醇粉末以 50 mL 實驗用芝麻油溶解,配成濃度為 30 μg / mL 的苯甲酸 β -雌二醇溶液置 4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?br/>
1. 2. 2 實驗分組
造模前,每日定時對所有小鼠進行陰道脫落細(xì)胞涂片(美藍染色法),連續(xù)觀察兩個動情周期,選取動情周期規(guī)律的小鼠用于實驗。 90 只實驗小鼠 中 48 只用于子宮內(nèi)膜異位癥模型建立,32 只作為假手術(shù)組,另外 10 只作為空白對照,用于模型對比 鑒定。 用于模型建立的 48 只小鼠按照 1 ∶ 2的比例 隨機分為供體鼠 16 只和受體鼠 32 只。 32 只受體小鼠隨機分為 4 組,每組 8 只,分別為種植后 1 周 組、種植后 2 周組、種植后 4 周組和種植后 6 周組。
1. 2. 3 建模方法
所述模型的建立方法,按如下步驟操作:
(1) 注射雌激素:所有實驗小鼠(包括供體鼠和 受體鼠) 頸背部皮下注射苯甲酸雌二醇溶液 150 μg / kg,每 4 天注射 1 次,共注射兩次。
(2) 從注射雌激素開始至腹腔種植當(dāng)日,每日 定時對供體鼠和受體鼠進行陰道脫落細(xì)胞涂片檢 查,觀察小鼠動情周期。 動情周期判斷依據(jù)如下: 動情前期:圓形或橢圓形的有核上皮細(xì)胞為主,夾 有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞;動情期:幾乎全是無核 的角化細(xì)胞;動情后期:角化細(xì)胞減少,出現(xiàn)有核上 皮細(xì)胞和白細(xì)胞;動情間期:細(xì)胞少而皺縮,白細(xì)胞為主。
(3) 種植前標(biāo)本準(zhǔn)備:供體小鼠的子宮取出用 預(yù)冷的生理鹽水清洗血液和粘液,將子宮一分為二分別放入盛有 0. 5 mL 預(yù)冷的 RPMI1640 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用眼科剪將子宮縱向剖開,剝離子宮內(nèi) 膜層并迅速將其剪成體積 ≤ 1 mm 3 的內(nèi)膜碎片制成懸浮液備用。
(4) 腹腔注射內(nèi)膜:受體小鼠腹部皮膚消毒后, 以 1 mL 注射器針筒接 20 mL 注射器針頭,以小鼠下 腹部正中尿道口上方 0. 5 cm 處為進針點,將子宮內(nèi) 膜碎片注射入受體小鼠腹腔,針孔處涂抹適量青霉 素軟膏預(yù)防感染,供體鼠與受體鼠數(shù)量比為 1 ∶ 2。 從取出供體小鼠子宮到注射子宮內(nèi)膜碎片入受體小鼠所有操作應(yīng)在 5 min 內(nèi)連續(xù)完成,全程保持無 菌。 假手術(shù)組注射雌激素的方法與模型組相同,不同的是,假手術(shù)組腹腔注射的是等體積的供體小鼠的腹腔脂肪組織。
(5) 種植后處理:腹腔種植內(nèi)膜當(dāng)日開始對受 體小鼠頸背部皮下注射苯甲酸β-雌二醇溶液 150 μg / kg,每 4 天注射 1 次,共注射兩次,之后待內(nèi)膜自然生長。
