細(xì)胞在平面上生長(zhǎng)是人為的和不自然的，因?yàn)檫@與細(xì)胞能夠以最佳狀態(tài)進(jìn)行旺盛生長(zhǎng)的體內(nèi)環(huán)境并不相同。因此，傳統(tǒng)的2D單層細(xì)胞培養(yǎng)物很難恰當(dāng)?shù)胤从吵黾?xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)而可能造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織功能的缺失。

三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能夠更好地模擬生物體內(nèi)細(xì)胞存活的自然環(huán)境，其自然條件可保持細(xì)胞間相互作用和更逼真的生化和生理反應(yīng)。在3D環(huán)境中，細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性和外源性刺激（如溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分化等方面的改變）應(yīng)答更接近于它們?cè)隗w內(nèi)的反應(yīng)。再生醫(yī)學(xué)的力量為理解發(fā)育、老化和組織年輕化等許多有趣的細(xì)胞進(jìn)程提供了方法，了解生物學(xué)中這些有趣過程的唯一方法就是研究與生物體非常相似的模型系統(tǒng)，這使得3D細(xì)胞培養(yǎng)成為必不可少的研究工具。

3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)很多，但總結(jié)起來(lái)可以分為3類：

~3D水凝膠~
1.基本原理：
水凝膠是水膨脹性的高分子網(wǎng)絡(luò)，被設(shè)計(jì)用來(lái)模擬復(fù)雜的細(xì)胞外微環(huán)境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長(zhǎng)因子組成。用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取的ECM聚合物，新一代的合成、混合或基于多肽的材料則可以制備滿足特定需求的培養(yǎng)環(huán)境，為每個(gè)細(xì)胞和應(yīng)用需求提供最合適的選擇

2.技術(shù)舉例：
2.1 天然水凝膠
ECM凝膠：從小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營(yíng)養(yǎng)，與細(xì)胞的發(fā)育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40°C熱激活，凝膠化過程也是可逆的(蛋白質(zhì)濃度:8–12mg/ml)。

MaxGel™ 胞外基質(zhì)：MaxGel人細(xì)胞外基質(zhì)源于體外培養(yǎng)的細(xì)胞基底膜，含有可預(yù)測(cè)的低水平內(nèi)源生長(zhǎng)因子，更適合需要更明確和特征再造BME的應(yīng)用，最終可降低實(shí)驗(yàn)的可變性。MaxGel人細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）含有多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白、層粘蛋白、纖連蛋白、腱生蛋白、彈性蛋白以及大量的蛋白聚糖及粘多糖等。用于細(xì)胞培養(yǎng)的ECM可以高效地重現(xiàn)上皮細(xì)胞與間質(zhì)在皮膚發(fā)育及器官型細(xì)胞培養(yǎng)過程中的協(xié)同作用。MaxGel™可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，已被證實(shí)可以促進(jìn)多種類型細(xì)胞的增殖，包括神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

Cultrex® 3-D培養(yǎng)工具： 3-D Culture MatrixTM RGF BME低生長(zhǎng)因子基底膜抽提物，經(jīng)過效果驗(yàn)證，專為滿足三維培養(yǎng)研究的需求而研制。為了提供最標(biāo)準(zhǔn)化的3D培養(yǎng)基底膜抽提物產(chǎn)品，采用一套特殊工藝來(lái)降低生長(zhǎng)因子以更好的保證批間一致性，并將基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)濃度控制在15 mg/ml左右，隨后在三維培養(yǎng)條件下對(duì)本品的效能進(jìn)行評(píng)估驗(yàn)證。

在3-D Culture Matrix™ RGF BME中培養(yǎng)16天后，對(duì)MCF-10A細(xì)胞進(jìn)行染色：A）細(xì)胞染色試劑盒（結(jié)構(gòu)）；B）SYBR®Green（細(xì)胞核）；C）MitoShift™（線粒體膜電位）； 3-D Culture Matrix™ RGF BME中培養(yǎng)12天后，對(duì)PC-3細(xì)胞進(jìn)行染色：D）Calcein AM（細(xì)胞活力）；E）CPA染料1（細(xì)胞核）；F）Depsipher™（線粒體膜電位）

天然水凝膠技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
-建立已久，支持文獻(xiàn)和應(yīng)用較多
-提供天然生物配體
-通常含有生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子

2.2 合成水凝膠
HyStem™細(xì)胞培養(yǎng)支架— 首款定制合成的ECM
HyStem產(chǎn)品是首個(gè)可定制的合成ECM，與體內(nèi)條件非常相近。使用HyStem 平臺(tái)，研究人員可控制生長(zhǎng)因子、黏附因子和ECM 蛋白的摻入、水凝膠硬度及細(xì)胞囊化等。由于HyStem 是一種合成的基質(zhì)，而不是生物提取物，所以研究人員能夠密切控制細(xì)胞環(huán)境的組成。HyStem 的成分包括化學(xué)合成的HyStem（巰基化透明質(zhì)酸）、Extralink™（硫醇反應(yīng)性交聯(lián)劑）、脫氣的水和生物純化的Gelin-S™（變性膠干細(xì)胞的天然環(huán)境富含透明質(zhì)酸，因此，HyStem 試劑盒是培養(yǎng)干細(xì)胞的最佳選擇。HyStem 水凝膠支架精密模仿了天然的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，含有豐富的透明質(zhì)酸和膠原纖維，同時(shí)具有定制靈活性，能加入適當(dāng)?shù)纳�長(zhǎng)因子、附著因子和蛋白。

Hystem可模擬天然的ECM結(jié)構(gòu)

HydroMatrix™多肽水凝膠
HydroMatrix™水凝膠是一種合成多肽納米纖維支架，通過高度交聯(lián)的多肽水性凝膠中的天然三維結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)合成基質(zhì)的精確控制。HydroMatrix支架可以在溫度或離子強(qiáng)度變化刺激下從液態(tài)前體自組裝為高度交聯(lián)的三維多肽水性凝膠。通過調(diào)整HydroMatrix溶液的濃度，研究人員可以控制3-D結(jié)構(gòu)的柔韌性，并對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪裁以滿足個(gè)人需求。HydroMatrix™可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，已被證實(shí)可以促進(jìn)多種類型細(xì)胞的增殖，包括神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

HydroMatrix多肽水凝膠可支持極佳的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在3種平面上進(jìn)行培養(yǎng)：NSCs在組織培養(yǎng)塑料平面生長(zhǎng)很差(A)，在多聚賴氨酸/層粘蛋白處理的平面上長(zhǎng)勢(shì)稍好(B)，但在0.5% (w/v)的HydroMatrix多肽水凝膠上表現(xiàn)出極佳的生長(zhǎng)狀態(tài)(C)

合成水凝膠技術(shù)優(yōu)勢(shì):
-明確無(wú)動(dòng)物源成分和病原物
-無(wú)生長(zhǎng)因子，無(wú)批間差異
-可通過額外添加特異的生物相關(guān)氨基酸序列實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步功能化

~細(xì)胞聚集~
1.基本原理：
基于細(xì)胞聚集的方法不需要額外添加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細(xì)胞數(shù)量、孵育時(shí)間和細(xì)胞增殖率等因素。

2.技術(shù)舉例：
2.1懸滴培養(yǎng)板
Perfecta3D®懸滴培養(yǎng)平板的孔板經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)，當(dāng)在小孔上方加入一滴細(xì)胞懸液時(shí)，孔板的幾何構(gòu)造就會(huì)引導(dǎo)細(xì)胞和培養(yǎng)基通過一個(gè)小洞，進(jìn)而形成一個(gè)穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個(gè)培養(yǎng)孔的上方，可用來(lái)更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子、小分子，也可用來(lái)加入細(xì)胞形成混合培養(yǎng)物。Perfecta3D®懸滴培養(yǎng)板每孔形成一個(gè)球體，且可控制球體大小以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。 96孔和384孔懸滴培養(yǎng)板與自動(dòng)化液體處理設(shè)備、微孔板讀數(shù)儀等兼容。

懸滴培養(yǎng)板技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
-球體大小和數(shù)量可控制，孔間數(shù)據(jù)可重復(fù)
-可使用液體處理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化
-使用較大球體可模擬缺氧狀態(tài)
-提供細(xì)胞混合的靈活性，種植前或球體形成后即可

2.2低粘附平面
Corning極低吸附平面是一種共價(jià)偶聯(lián)了水凝膠的親水不帶電平面，以盡可能的降低細(xì)胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細(xì)胞以懸浮不貼壁的狀態(tài)生長(zhǎng)。

低粘附培養(yǎng)平面技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
-可形成較大的球形體
-U型或V型底的96/384孔平板每孔可產(chǎn)生單個(gè)球體

2.3 3D Petri Dish
MicroTissues 3D 培養(yǎng)皿是不基于支架的天然3D 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，可最大限度模擬細(xì)胞間的相互作用和信號(hào)交流。該產(chǎn)品線包括多種規(guī)格的微組織培養(yǎng)系統(tǒng)，適配標(biāo)準(zhǔn)的12孔和24孔培養(yǎng)板，可應(yīng)用于形成球狀體、乳腺癌細(xì)胞球、膠質(zhì)瘤細(xì)胞球、肝細(xì)胞球、軟骨細(xì)胞球、骨細(xì)胞球、神經(jīng)細(xì)胞球、心肌細(xì)胞球，以及細(xì)胞聚集體和擬胚體等多種細(xì)胞培養(yǎng)模式。

3D 培養(yǎng)皿制備流程圖

3D 培養(yǎng)皿技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
-單次移液操作即可獲得上百個(gè)相同大小的球體
-可從單細(xì)胞克隆形成球體
-可在同一平面對(duì)一組球體進(jìn)行成像
-可形成復(fù)雜形態(tài)的微組織

~培養(yǎng)支架~
1.基本原理：
支架可提供一種物理支撐，細(xì)胞可以進(jìn)入支架生長(zhǎng)和行使功能。孔隙分布、暴露平面區(qū)域和孔隙度具有關(guān)鍵作用，其數(shù)量和分布會(huì)影響細(xì)胞滲透入支架的效率，而依據(jù)不同的制作工藝，支架具有不同的結(jié)構(gòu)、隨機(jī)或定制的孔隙分布。

支架可以通過包被或功能化以產(chǎn)生不同的特性和影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和行為，且有些“支架”技術(shù)還和“水凝膠”技術(shù)有著密切的關(guān)系。

2.技術(shù)舉例：
支架的種類很多，基本可以分為：1. 天然支架如膠原、明膠、纖維蛋白、幾丁聚糖、粘多糖、瓊脂糖和海藻酸等，天然支架具有生物兼容性，但穩(wěn)定性較差；2. 合成支架如聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚氨酯等，合成材料具有一致性、穩(wěn)定性，但惰性、堅(jiān)硬，生物兼容性較差

培養(yǎng)支架技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

-可實(shí)現(xiàn)器官型共培養(yǎng)-模擬分層的組織結(jié)構(gòu)
-與現(xiàn)有的塑料制品格式和下游分析方法兼容
-結(jié)構(gòu)一致具有可重復(fù)性，兼容高通量

小結(jié)：不同3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)都各有優(yōu)勢(shì)和不足，因此在選擇合適的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)需要考慮多方面因素，比如要解決的問題或研究目的、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�、�?xì)胞類型、技術(shù)可實(shí)現(xiàn)性、下游分析方法和樣品數(shù)量等。
 
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